سی‌ام اردیبهشت 1307، حسین پیرنیا رییس مجلس شورای ملی، در حکمی قانون اجازه تشکیل بانک ملی ایران را اعلام کرد. این قانون، مشتمل بر 15 ماده بود که در آن به مواردی چون مکلف کردن دولت به تاسیس این بانک برای پیشرفت امر تجارت، فلاحت، زراعت و صناعت با مرکزیت تهران، آغاز به کار بانک و شرایط پرداخت قرض به وسیله دولت، تبیین وظایف رییس بانک و ضرورت به‌کارگیری زبان و خط فارسی در تمامی دفاتر و... اشاره شده بود. در روز سه‌شنبه20 شهریور 1307 بانک ملی ایران در تهران رسماً کار خود را آغازکرد.
نخستین مدیرعامل بانک ملی دکتر کورت لنیدن بلات و معاون او فوگل به همراه 70 کارشناس از کشور آلمان به ایران آمدند. بر حسب اساسنامه بانک، بانک ملی ایران به صورت یک شرکت سهامی دارای شخصیت حقوقی شناخته شد و تابع قوانین تجاری تلقی گردید.
سرمایه اولیه بانک 20 میلیون ریال بود که فقط 8 میلیون آن پرداخت شد و در سال 1314 سرمایه بانک به 300 میلیون ریال و در سال 1331 به 2میلیارد ریال افزایش یافت که تمام آن پرداخت شده است. این سرمایه در حال حاضر با افزایشی که در سال 95 داشت بالغ‌بر 187هزار میلیارد ریال است. با توجه به اینکه در آن تاریخ متخصصین بانکی در ایران وجود نداشت به موجب قانونی اجازه استخدام اتباع سوییسی یا آلمانی به منظور اداره بانک داده شد. تعداد کارکنان بانک در روز افتتاح اعم از ایرانی و آلمانی از 27 نفر تجاوز نمی‌کرد.
در ابتدای تاسیس بانک علاوه بر شعبه مرکزی دو شعبه در بازار تهران و بندربوشهر که مهم‌ترین بندر بازرگانی آن روز ایران بود تاسیس گردید.
نخستین نمایندگی بانک در خارج از کشور در سال 1327 در هامبورگ تاسیس شد.
سال 1305 بنگاهی به نام موسسه رهنی دولتی ایران، از محل وجوه صندوق بازنشستگی کارکنان دولت برای رفع حوائج مردم به وجود آمد که تا سال 1307 تحت نظر وزارت دارایی اداره می‌گردید پس از تاسیس بانک ملی به این بانک واگذار و در سال 1318 این موسسه به نام بانک کارگشایی مرسوم و یکی از سازمان‌های تابعه بانک ملی محسوب شد.
بیست‌ودوم اسفند 1310 حق نشر اسکناس از تصویب مجلس شورای ملی گذشت و رسماً به مدت 10 سال بانک ملی ایران اعطا شد که به خودی خود قابل تمدید بود و در فروردین ماه 1311 نخستین اسکناس بانک ملی ایران انتشار یافت.
